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ELISA實(shí)驗常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案
一、顯色異常問(wèn)題
白板(無(wú)顯色)?
原因?：試劑失活(如HRP污染或底物失效)、漏加關(guān)鍵組分(酶標抗體/顯色劑)、孵育溫度或時(shí)間不足?。
解決?：更換新鮮試劑，檢查加樣步驟，確保37℃孵育1-2小時(shí)并避光?。
高背景/非特異性顯色?
原因?：封閉不充分(如BSA濃度不足)、洗滌不凈(殘留未結合物質(zhì))、抗體濃度過(guò)高或交叉反應?。
解決?：優(yōu)化封閉條件(延長(cháng)至1-2小時(shí))，增加洗滌次數(5次，每次1分鐘)，調整抗體稀釋比例?。
二、重復性差
加樣誤差?：復孔間加樣量或時(shí)間不一致，導致CV%>20%?。
洗板不均?：洗板機管道阻塞或手工洗板力度不一致?。
解決方案?：使用同一移液器，規范加樣速度;檢查洗板機或手動(dòng)充分拍干?。
三、假陽(yáng)性/假陰性
假陽(yáng)性?
溶血/細菌污染?：紅細胞釋放過(guò)氧化物酶或細菌內源性HRP干擾?。
類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)?：與IgG Fc段非特異性結合?。
處理?：離心去除溶血樣本，添加RF阻斷劑?。
假陰性?
抗原降解?：反復凍融或保存時(shí)間過(guò)長(cháng)?。
競爭法操作錯誤?：如先加酶標抗體后加樣本?。
處理?：分裝凍存樣本，嚴格按說(shuō)明書(shū)順序加樣?。
四、標準曲線(xiàn)異常
標曲擬合差(R2<0.99)?：標準品稀釋錯誤或酶標儀波長(cháng)設置不當?。
批間差異?：不同批次試劑活性波動(dòng)，可用校正因子“S"校準歷史數據?。
五、關(guān)鍵操作注意事項
加樣?：槍頭懸空加至孔底，避免觸碰孔壁或濺灑?。
孵育?：覆蓋封板膜防止蒸發(fā)，避免疊放導致溫度不均?。
洗滌?：使用含0.05% Tween-20的洗滌液，拍干?。
六、其他常見(jiàn)問(wèn)題
邊緣效應?：周邊孔顯色偏強，建議質(zhì)控孔置于板中央?。
酶標板選擇?：聚苯乙烯板需評估吸附性能，避免批次差異?。
(注：具體問(wèn)題需結合試劑盒說(shuō)明書(shū)及實(shí)驗條件調整?。)
注：以上資料僅供參考，不作為實(shí)驗數據，具體請咨詢(xún)品牌供應商或技術(shù)老師;
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